1. Cosa fa una centrifuga

2. Modi di centrifugazione

3. Tipi di equipaggiamenti e loro funzioni

4. Selezione delle provette

5. Sterilizazione e Decontaminazione degli Equipaggiamenti

1.Cosa fa una centrifuga

Particelle in sospensione in una soluzione lasciata decantare per un tempo determinato, si depositano sul fondo del contenitore spinte dalla forza di gravità terrestre.
In alcuni casi (fluidi biologici) il tempo impiegato per la sedimentazione spontanea sarebbe troppo lungo e alcune particelle impiegherebbero anni per sedimentare.
Se lo stesso contenitore viene fatto ruotare in circolo, la soluzione viene sottoposta ad una forza di gravità artificiale proporzionale alla distanza dal centro di rotazione e al quadrato della velocità di rotazione.
Con la centrifuga si puo’ quindi generare un aumento di gravità rispetto alla gravità terrestre accelerando il processo di sedimentazione.
La forza di gravità relativa a quella terrestre sviluppata artificialmente dalla centrifuga viene chiamata RCF (Relative Centrifugal Force), e si indica con "x g".
Per il calcolo della forza di gravità, si utilizza la seguente formula:

RCF = 11.178 x r x (rpm/1.000)2

r = raggio dell’equipaggiamento (cm.)
rpm = velocità di rotazione (revolution per minute)

Per ogni rotore si puo’ calcolare:
RCF massima (r max) in relazione al raggio massimo dell’equipaggiamento
RCF minima (r min) in relazione al raggio minimo dell’equipaggiamento
RCF media (r avg) in relazione al raggio medio dell’equipaggiamento

Fattore-k (k-factor)
Viene utilizzato per calcolare il tempo necessario per sedimentare particelle di una soluzione dalla parte superiore a quella inferiore della provetta; (dal raggio minimo al raggio massimo dell’equipaggiamento).
Il fattore-k, anche conosciuto come "clearing factor," si utilizza per indicare l’efficienza dell’equipaggiamento rotante.

La determinazione del fattore-k si calcola con la formula seguente:

k = 253.300 ln ( r max/r min)

(rpm/1.000)2

r max : raggio massimo dell’equipaggiamento
r min : raggio minimo dell’equipaggiamento
rpm : velocità di rotazione

Per determinare il tempo necessario alla sedimentazione di particelle in sospensione (pelleting), si utilizza la seguente formula:

t = k/S20w

t : Tempo in ore
k : Fattore-k
S20w : Coefficiente di sedimentazione in unità Svedberg (Svedberg-unit), che dipende dalle dimensioni e dalla densità della particella.
20w : Indica che le particelle sono in soluzione acquosa a 20°C

concludendo, si deduce:

<< fattore-k << tempo di centrifugazione >> efficienza

2. Modi di centrifugazione

La separazione delle particelle per forza di gravità, si puo’ ottenere con i seguenti modi di centrifugazione:

• Centrifugazione Differenziale o Pelleting Differenziale
• Centrifugazione in Gradiente di Densità

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
(Pelleting Differenziale)

L’obiettivo è la separazione di una sospensione di particelle in un liquido in due distinte fasi:
- Sedimento (Pellet)
- Supernatante
La velocità di sedimentazione dipende dalle dimensioni e dalla densità della particella;. l’efficienza del Pelleting è proporzionale alla forza di gravità (RCF) applicata e al tempo di centrifugazione.
Anche la forma fisica dell’equipaggiamento influisce sul grado di sedimentazione; infatti il principio di convezione, che permette la circolazione del liquido nella provetta, risulta molto piu’ accentuato nei rotori ad angolo che nei rotori oscillanti.
Di conseguenza, la velocità di sedimentazione nel metodo Differenziale, a parità di velocità di rotazione, risulta piu’ efficace nei rotori ad angolo che nei rotori oscillanti.

Influenza del Coefficiente di Sedimentazione (s-unit o Svedberg-unit)
Durante la centrifugazione le particelle del campione, sedimentano ad una velocità determinata dal rispettivo coefficiente di sedimentazione "s" (s-unit).
Il valore di "s" dipende dalle dimensioni della particella, dalla forma e dalla densità specifica.

Influenza della fragilità delle particelle
Alcune categorie di particelle, durante il percorso a convezione nella provetta, possono danneggiarsi nell’impatto con le pareti della provetta, cosicchè risulta indispensabile l’utilizzo di equipaggiamenti "diversi": orizzontali o oscillanti (swing-out)

Influenza del volume del campione
La velocità di rotazione è inversamente proporzionale al volume del campione; quindi quando necessita una maggior forza di gravità artificiale RCF (Relative Centrifugal Force) si deve utilizzare rotori con capacità del campione piu’ piccola.

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

Gradiente
L’obiettivo è la separazione di tipi diversi di particelle di una soluzione eterogenea in strati definiti (bande) in un gradiente a densità variabile.
Quando il posizionamento finale delle particelle nel gradiente dipende principalmente dalla massa e dalle dimensioni della particella; la separazione si chiama Zonale (Rate-zonal) ed è dipendente dalla durata della centrifugazione.
La centrifugazione deve quindi terminare quando le particelle sono sedimentate in zone definite ma ancora in sospensione.
Quando il posizionamento finale delle particelle dipende esclusivamente dalla densità della particella; la separazione si chiama Isopicnica ed è indipendente dalla durata della centrifugazione.
In tal caso anche aumentando il tempo di centrifugazione, le particelle rimangono in equilibrio nel gradiente in relazione alla loro densità specifica e a quella del gradiente.

Influenza delle dimensioni e della densità della particella
La scelta di uno dei due modi di centrifugazione in Gradiente di Densità (Rate-zonal o Isopicnico) e del tipo di rotore da utilizzare, dipende dalle caratteristiche fisiche delle particelle da separare.
Se le particelle da separare differiscono tra loro per le dimensioni e per la densità specifica, si deve utilizzare il modo di centrifugazione zonale in rapporto di velocità (Rate-zonal).
Se invece le particelle da separare differiscono tra loro esclusivamente dalla loro densità specifica la centrifugazione isopicnica risulta piu’ efficace (in termine di tempo).

CENTRIFUGAZIONE ZONALE (Rate-zonal)

La sedimentazione delle particelle nel campione avviene in una soluzione con densità variabile ma inferiore a quella delle particelle, cosicchè la velocità di sedimentazione è direttamente dipendente dalla massa della particella.
Le particelle vanno a posizionarsi in zone distinte (layer), in funzione della loro massa.
L’effetto della separazione dipende dalla durata della centrifugazione; quindi la centrifugazione deve terminare quando le particelle sono ancora sospese nel gradiente.
Viceversa, aumentando il tempo di centrifugazione le particelle vanno a sedimentarsi sul fondo della provetta (Pelleting).

Tipo di equipaggiamento
La separazione zonale di particelle viene eseguita utilizzando equipaggiamenti Orizzontali o Oscillanti (Swing-out), Zonali e Verticali.
La velocità di sedimentazione delle particelle, aumenta in modo quadratico con il diametro della stessa e in modo lineare con la densità specifica.
Per alcune particelle, come cellule, organi subcellulari di grandi dimensioni (nuclei, mitocondri, ribosomi) l’utilizzo di equipaggiamenti Oscillanti, Zonali e Verticali forniscono un adeguata separazione in un tempo di centrifugazione moderato e con una velocità di rotazione non eccessiva (centrifughe ad alta velocità o High-speed).
Per particelle piu’ piccole (macromolecole, virus di piccole dimensioni, piccole frazioni subcellulari) è indispensabile utilizzare, con gli stessi tipi di equipaggiamenti, velocità di rotazione molto elevate (ultracentrifughe).
Con la centrifugazione zonale, gli equipaggiamenti angolari sono, per alcune applicazioni, inadeguati perchè la particella in movimento convettivo tende a distruggere l’equilibrio delle zone in formazione all’interno della provetta.

CENTRIFUGAZIONE ISOPICNICA

Con la separazione isopicnica le particelle, depositate sul livello superiore del gradiente, sedimentano fino alla loro posizione di equilibrio determinata dalla uguaglianza della densità della particella con quella del gradiente in quel punto (iso).
Le particelle vengono quindi separate solo in base alla loro differenza di densità, indipendentemente dalle dimensioni della particella.
Di conseguenza, la durata della centrifugazione, ad equilibrio raggiunto, è ininfluente.

Tipo di equipaggiamento
Gli equipaggiamenti piu’ indicati per questo tipo di separazione sono quelli Angolari e Verticali.

Configurazione degli equipaggiamenti
Angolo fisso La circolazione convettiva del liquido nella provetta di un equipaggiamento ad angolo fisso favorisce il posizionamento isopicnico delle particelle nel gradiente.
Verticale Il percorso (path-lenght) ridotto della particella nella provetta e la conseguente aumentata efficienza (<< k-factor) riducono sostanzialmente il tempo di centrifugazione.
Oscillante (swing-out) Ha una elevata risoluzione ma è meno efficiente in termini di tempo di centrifugazione, a causa del lungo percorso (path- lenght) della particella nella provetta che aumenta il tempo totale di separazione (>> k-factor).

3. Tipi di equipaggiamenti e loro funzioni

Angolo fisso
Le provette sono posizionate nel corpo dell’equipaggiamento con un angolo rispetto all’asse di rotazione che varia da 15 a 45 gradi. Appena il rotore inizia a girare, e durante la fase di accelerazione, la soluzione contenuta nella provetta si riorienta in posizione parallela all’asse di rotazione e le particelle iniziano a sedimentare sul fondo della provetta.
Nella fase di decelerazione, la soluzione si riposiziona orizzontalmente e la gravità naturale prevale su quella artificiale.
Equipaggiamenti con basso angolo hanno una maggior efficienza di sedimentazione; infatti la riduzione del percorso effettivo delle particelle (path-length) diminuisce il fattore-k riducendo la durata della centrifugazione. (vedi fattore-k)
Si deduce che l’equipaggiamento angolare è molto efficace per pelleting, tanto piu’ che la sedimentazione viene favorita dal movimento convettivo del liquido all’interno della provetta e dall’effetto parete creatosi.
La circolazione convettiva del liquido, infatti, fa si che la particella colpendo la parete della provetta scivola verso il basso aumentando la propria velocità di sedimentazione.
La forma fisica e la costruzione meccanica degli equipaggiamenti angolari permettono forze di gravità relative (RCF) maggiori di 900.000 xg (per i modelli in titanio).
Esistono alcuni equipaggiamenti angolari con angolo inferiore a 10 gradi che vengono chiamati "Near-vertical" (NVT Beckman TM) o "Neo-angle".(Hitachi).
In questi equipaggiamenti, il fattore-k è molto basso (<< 12), con conseguente alta efficienza.
Per alcune particelle gli equipaggiamenti angolari sono inadeguati per la separazione zonale perchè la particella, che colpisce la parete della provetta nel moto convettivo del liquido, variando la propria velocità di sedimentazione, puo’ danneggiare le zone in formazione.
Lo slittamento della particella sulla parete della provetta, al contrario, favorisce la separazione isopicnica; si deduce quindi, che l’equipaggiamento angolare si adatta positivamente per essere utilizzato nella separazione isopicnica in gradiente di densità.

Orizzontale o Oscillante (Swing-out)
Gli equipaggiamenti oscillanti sono composti da un corpo rotore (testa) e da una serie di contenitori o portaprovette (buckets) agganciati al corpo principale dell’equipaggiamento.
Quando l’equipaggiamento è fermo, i portaprovette (buckets) si trovano in posizione verticale; appena l’equipaggiamento inizia a ruotare, i portaprovette oscillano in posizione orizzontale perpendicolare all’asse di rotazione, cosicchè la separazione delle particelle nella soluzione avviene lungo l’asse della provetta in direzione radiale.
Alla fine della rotazione i portaprovette ritornano in posizione verticale.
La separazione avviene senza riorientamento del liquido o del gradiente contenuto nella provetta.
Il fattore-k di questi rotori è elevato a causa dell’elevato percorso (path-length) della particella che è determinato dalla lunghezza della provetta. Questo lo rende inadatto per la sedimentazione (pelleting), mentre risulta ideale per le separazioni isopicniche e zonali di particelle di medie e grandi dimensioni (cellule) con ottima risoluzione.

Gli equipaggiamenti oscillanti, utilizzati nelle centrifughe a medio-alta velocità, sono costruiti con un schermo esterno (windshield) che permette di ridurre l’attrito con l’aria durante la rotazione. Conseguentemente viene incrementata la velocità di utilizzo, mantenendo efficiente del controllo della temperatura all’interno della camera di centrifugazione e del campione.
La costruzione meccanica non permette forze di gravità troppo alte (< 300.000 xg anche per i modelli in alluminio-titanio)

Verticali
Viene anche considerato equipaggiamento angolare con angolo di zero gradi, essendo le provette posizionate parallele all’asse di rotazione.
In accelerazione (< 1.000 rpm) la soluzione all’interno della provetta si riorienta in posizione verticale e il percorso della particella in fase di separazione si riduce al diametro della provetta. Di conseguenza il fattore-k risulta molto basso e l’efficienza molto alta.
Viene esclusivamente utilizzato per centrifugazioni isopicniche in gradiente di densità, dove è necessario utilizzare accelerazioni e decelerazioni relativamente lunghe, allo scopo di permettere il riorientamento del gradiente (da orizzontale a verticale), senza essere danneggiato dalla eccessiva accelerazione centrifuga.
La costruzione meccanica molto compatta permette altissime RCF (> 900.000 xg)

Zonale (Batch-rotor)
L’equipaggiamento zonale è un rotore dove la soluzione da centrifugare viene messa direttamente a contatto delle pareti del corpo rotore anzichè nelle provette.
Infatti, viene conosciuto anche come "rotore a vasca".
Progettato per ottimizzare la centrifugazione zonale su larga scala (Large Scale Separation), ma utilizzabile anche per separazioni isopicniche e per centrifugazioni a "flusso continuo"(purificazione di liquidi di fermentazione, separazione di virus ecc.).
La capacità dell’equipaggiamento varia da 330 ml a 1.675 ml.
Inadatto, come il rotore verticale, per pelleting.
Hanno un buon grado di resistenza alle gravità medio-alte, ma a causa di alcune parti interne di materiale meno resistente (separatore o septa-core), la RCF massima viene limitata a circa 170.000 xg.

LA SCELTA DELL’EQUIPAGGIAMENTO DIPENDE DA:

• TIPO DI APPLICAZIONE
• COEFFICENTE DI SEDIMENTAZIONE ( S-UNIT )
• FRAGILITA’ MECCANICA DELLE PARTICELLE DA SEPARARE
• VOLUME TOTALE DEL CAMPIONE
• NUMERO DEI CAMPIONI

4.Selezione delle provette
I prodotti chimici influenzano le caratteristiche meccaniche, la flessibilità e le proprietà fisiche delle provette.
La resistenza chimica viene influenzata anche dalla temperatura di centrifugazione, dalla concentrazione del prodotto chimico utilizzato e dalla Forza Centrifuga Relativa (RCF).

I materiali per provette piu’ utilizzati

Polipropilene copolimero (PPCO) Copolimero lineare con aggiunta di etilene e propilene; disponibile con parete sottille e spessa, normalmente elencato come PA (Poliallomero).Ha buone proprietà chimiche e di media trasparenza; adatto per pelleting e separazione in gradiente di densità. Eccellente per essere tagliato (sliceable) o perforato (pierceable) e ideale per centrifugazioni a bassa temperatura.

Policarbonato (PC) Trasparente e rigido, buona resistenza agli acidi con ottima compatibilità verso le soluzioni di acido diluito. Disponibile con parete spessa e sottile, in tubi o bottiglie. Autoclavabile e riutilizzabile.

Polipropilene Traslucido (PP). Buone proprietà chmiche. Richiesto quando è necessario ottenere una netta interfaccia tra separazioni di particelle con diverso coefficiente di densità (layer).

Politene (CPE) Polimero opaco, ideale per acido acetico o idrofluorico. Adatto per taglio e foratura, nelle centrifugazioni in gradiente. Utilizzato quando necessitano basse temperature di centrifugazione.

Polistirene (PS) Rigido e non tossico; trasparente e compatibile con la maggior parte delle soluzioni acquose. Normalmente utilizzato per pelleting.

Polisulfone (Phenylene-Isopropylidene) (PSF) Di colore giallo trasparente. Resistente agli acidi, basi, alcool e idrocarburi. Ottima resistenza alla temperatura.

Teflon FEP (FEP) Traslucido, flessibile e ad alta densità. Resiste a temperature di esercizio molto basse. Eccellente con Acetone e altri solventi. Autoclavabile e sterilizzabile. Riduce le proprie qualità quando utilizzato ad alta forza di gravità con temperature >20 °C.

Corex (C) Per centrifugazioni a basse e medie velocità. Cinque volte piu’ resistente del vetro convenzionale. Buono per alte temperature.

5.Sterilizazione e Decontaminazione degli Equipaggiamenti

Tecniche di Sterilizazione
La sterilizzazione a vapore in autoclave deve essere fatta alla temperatura di 121°C con una pressione di 1 atm (15 psi), per circa 15 minuti.
Tutte le parti degli equipaggiamenti rotanti (coperchi, buckets, O-ring etc.) devono essere separate dal corpo dell’equipaggiamento prima della sterilizzazione.
Se si deve utilizzare Gas di Formaldeide, Ossido di Etilene o altre metodiche, si consiglia di consultare i rispettivi manuali di riferimento.
I coperchi ermetici in Policarbonato (PC) possono essere moderatamente intaccato durante la sterilizzazione in autoclave.
In tal caso, si possono utilizzare differenti tecniche (Ossido di Etilene, etc.).

Decontaminazione
La decontaminazione Radioattiva e la disinfezione biologica puo’ essere eseguita utilizzando alcool (Etanolo o Isopropanolo) diluiti con acqua distillata e seguendo strettamente le istruzioni dei manuali specifici di riferimento.

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